La llegada de Isabel de Portugal a Sevilla en 1526, con motivo de su matrimonio con Carlos V, supuso la reactivación de un espacio de lecturas femeninas en la corte española, interrumpido tras la imposibilidad de que su tía —y ahora suegra—, Juana la Loca, reina de Castilla, ejerciera dicho papel. Nieta de la reina Católica, Isabel encarnaba la esperanza de restaurar el esplendor cultural y social de la corte castellana, perdida tras la muerte de aquella en 1504. A través de sus libros, sus encargos y su legado, la emperatriz contribuyó a perpetuar una tradición de lectura y de cultura femeninas que, aunque limitada en sus aspiraciones intelectuales, resultó fundamental para la configuración del entorno cortesano y la evolución del libro en la Monarquía Hispánica. Debe advertirse, no obstante, que Isabel de Portugal no fue una mujer de erudita cultura, ni una apasionada bibliófila. A su muerte, su escasa librería estaba formada por menos de un centenar de obras. Sin duda, ha ayudado a difundir esta imagen humanística de la soberana el retrato póstumo que de ella hizo Tiziano (Museo del Prado). En este retrato Isabel aparece sosteniendo en una de sus manos un librito, quizás de Horas. Ahora bien, el artista veneciano proporcionó a este pequeño volumen una encuadernación típicamente italiana. Quizás Tiziano, gran amigo de Pietro Aretino, quiso poner en sus manos el ejemplar de las Estancias en alabanza de la Sirena, que el propio autor había enviado a la soberana y que ésta le agradeció con un collar de oro, valorado en 300 escudos. Sea como fuere, no cabe duda de que este constituye el mejor retrato pictórico de Isabel, a pesar de ser una obra póstuma e idealizada. Tal vez, por ello, su verdadero retrato no sea el que trazó Tiziano, sino aquel que podemos descubrir a través de sus libros, como el que sostiene en este célebre cuadro.

Sus primeras lecturas se produjeron en Portugal. Sobre su educación en la corte lisboeta sabemos poco, solo que su maestro Álvaro Rodríguez, un capellán del rey Manuel I, ajustó sus lecciones a unos modelos de piedad femenina ya tradicionales en la formación regia de la época. Este modelo educativo contrastaba con el de su madre, la reina María. Los Reyes Católicos procuraron que sus hijas tuvieran una formación más amplia. La propia reina María tuvo como preceptor al humanista italiano Alixandre Giraldino entre 1493 y 1498. Sin embargo, debe recordarse que las circunstancias fueron muy diferentes, los soberanos españoles solo tuvieron un hijo varón, el príncipe don Juan, y cuatro hijas. No era improbable que la sucesión recayera en alguna de ellas (como así fue). En cambio, Manuel I de Portugal tuvo catorce hijos legítimos. Así pues, en Portugal nunca se contempló la posibilidad de que Isabel o su hermana Beatriz tuvieran que suceder a su padre en el trono, reservando para sus hermanos —Juan (futuro rey), Luis, Fernando, Alfonso, Enrique (último rey de la dinastía Aviz) y Eduardo— una educación humanística pensada para el desempeño posterior de labores de gobierno, civil, militar o eclesiástico.

Si bien Isabel de Portugal quedó al margen de este modelo educativo, la influencia de su madre ayudó a elevar el nivel de su formación religiosa y artística. Cuando la reina María falleció en 1517, Isabel pasó a ocupar su lugar en la corte de Lisboa. No en vano, heredó parte de los bienes suntuarios de su madre: ropas, telas, vajilla, pinturas y, por supuesto, libros. Se conservan varios inventarios de los bienes de la emperatriz, pero ninguno previo a su boda. En el primero —fechado en 1526— apenas se mencionan cuatro libros, todos de uso devoto o litúrgico. Estos códices iluminados fueron valorados especialmente por sus ricas encuadernaciones —con piezas de oro y plata y algunas piedras preciosas— y no tanto por su contenido.