La que estaba llamada a ser emperatriz nació en los albores del siglo XVI, en la noche del 24 de octubre de 1503, en el desaparecido palacio de Alcáçova de Lisboa. Por parte paterna, pertenecía a la dinastía portuguesa Avis, ya que era hija de Manuel I el Afortunado. Por parte materna, era una Trastámara pues su madre fue María de Aragón, hija de los Reyes Católicos. Isabel era la segunda de los vástagos de ese fértil matrimonio: a su nacimiento, la sucesión al trono ya estaba asegurada por la existencia de un príncipe heredero, pero Isabel vino a convertirse en la primera infanta de la familia real portuguesa, colmando de satisfacción a sus progenitores.

Su infancia trascurrió en la fastuosa corte manuelina, plena de lujos y exotismos. Isabel fue una de esas mujeres cultas del Renacimiento, pues tuvo acceso a una educación letrada que no se limitaba a la formación religiosa y básica, sino que trascendía a diversas lenguas romances destacando el castellano —lengua de su madre— y abarcando la lectura de los clásicos. La responsable de su educación fue la dama castellana Elvira de Mendoza. En la vida familiar fue afortunada, pues ninguno de sus ocho hermanos y hermanas murió en la infancia salvo la pequeña María (1511-1513) y no fue hasta los 18 años cuando perdería a su padre y vería cómo su hermano mayor ascendía al trono como Juan III. No obstante, ya a los catorce años había experimentado la muerte de su madre, víctima de su décimo parto.

En vísperas de su matrimonio, Isabel era una doncella hermosa, educada y plenamente desarrollada. Por fortuna para ella, no era una de esas tiernas adolescentes a las que las familias reales utilizaron como meros peones para entablar relaciones diplomáticas sin escrúpulos: en 1525 ya contaba con 22 años, una edad que en su época se consideraba más que adecuada para contraer matrimonio. El enlace con su primo Carlos de Habsburgo, próximo en edad, nunca fue una sorpresa para ella pues, desde su infancia, fue contemplado como la opción dinástica más deseable. Tanto fue así que la propia infanta pareció interiorizar el hecho como su destino.

Aunque la formalización de este matrimonio se hizo esperar y tuvo que competir con otras muchas candidatas, se dice que Isabel nunca desistió de él. Pese a que la boda tuvo lugar por poderes en Almeirim y la novia tuvo que viajar hasta Sevilla, donde el novio se hizo esperar una semana, estos esfuerzos no la agotaron. A pesar de que el equipamiento de los reales alcázares de Sevilla se le antojó tan pobres y austeros que años más tarde se implicaría en su remodelación, no pareció defraudada. De hecho, tan pronto como Carlos le conoció, el escaso entusiasmo que había demostrado por un enlace elegido de forma puramente racional dio paso a un radical cambio de actitud, por lo que podría decirse que Isabel desempeñó su papel a la perfección: demostró saber ganarse a su esposo de forma inmediata y perdurable.

Se suele decir que Carlos e Isabel tuvieron una vida familiar feliz durante sus trece años de matrimonio. Sobre la relación entre los esposos se conocen numerosos signos de afecto durante su luna de miel. No obstante, los asuntos de gobierno provocaron largas ausencias del Emperador: la más prolongada fue la segunda, desde 1529 hasta 1533, en que Isabel se quedó en Castilla criando a tres hijos. La tercera ausencia, de 1536 a 1537, fue seguida de una cuarta de 1538 a 1539. Durante los viajes de Carlos, Isabel le escribió cartas regularmente, de ahí que se conozcan detalles de su vida privada, aunque el contenido político fue mayoritario en esa correspondencia. Estas separaciones causaron problemas de salud, físicos y anímicos a ambos amantes, según los testimonios de los cronistas. En particular, la emperatriz se dejó ver melancólica, vestida de negro, incluso depresiva en las últimas ausencias. A pesar de esta vida conyugal discontinua, la pareja tuvo ocasión de concebir siete vástagos.

La emperatriz Isabel heredó de su madre tanto la fertilidad como su trágico destino: tuvo siete gestaciones y murió a los 35 años, víctima de la última. La mayor parte de sus partos tuvieron lugar en los meses primaverales. Sus tres primeros hijos, nacidos en 1527, 1528 y 1529 con intervalos de poco más de un año, fueron fruto de una intensa convivencia inicial de la pareja imperial que demostró la competencia de la emperatriz a la hora de asegurar la continuidad dinástica, misión fundamental —no es necesario recordarlo— para una reina de aquellos tiempos. Desgraciadamente, al regreso de su larga ausencia y ya coronado emperador, Carlos tuvo el disgusto de descubrir que su tercer hijo no había superado el primer año de vida, de ahí que el matrimonio restableciera su ritmo reproductivo anual en 1534 y 1535, aunque con dispar suerte ya que uno de los dos hijos no sobreviviría al embarazo. Isabel siempre tuvo una salud frágil y una complexión delgada pero, en 1537 y 1539, sufrió sendos varapalos con la muerte de su bebé de seis meses que dejó afectada su salud, a lo que se sumó un aborto temprano que fue seguido, tras diez días de fiebres tercianas, de su propio fin a los treinta y cinco años de edad.